| 题名 | 红平红球菌rpf基因突变、生物活性及应用研究 |
| 作者 | 罗旦 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 导师 | 陈吉祥 ; 谢刚 |
| 关键词 | 红平红球菌 非可培养状态 复苏促进因子 溶菌酶 石油降解菌 |
| 学位名称 | 硕士 |
| 英文摘要 | 自然环境拥有丰富的微生物资源,目前实验室条件下能够培养的微生物只占总量的0.01%-1%。复苏促进因子Rpf（Resuscitation promoting factor,Rpf）是首次被发现能够促使休眠细菌复苏和生长的细胞因子。石油污染长期危害自然环境和人类健康,微生物修复已成为石油污染土壤修复的主要技术之一,然而自然环境中许多有石油降解活性的微生物处于难培养状态。本文通过突变技术研究红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）复苏促进因子Rpf的生物学性质及对休眠细胞的复苏促进作用,探究Rpf作用机理,并将纯化的重组Rpf蛋白用于自然环境中高效石油污染降解菌的分离筛选。将红平红球菌KB1的rpf基因重组质粒BL21-pET-32a-rpf在大肠杆菌中高效表达,利用Ni琼脂糖亲和层析纯化重组Rpf蛋白,SDS-PAGE电泳分析其表达蛋白的分子量为37 kDa,重组Rpf蛋白的溶菌酶活力为1760 U/mg,蛋白酶活力为1634 U/mg。0.1 mM的Zn2+能增加溶菌酶活性,Ca2+、Mg2+、Co2+、DTT、EDTA、PMSF等对其溶菌酶活性影响不明显。纯化的重组Rpf蛋白对红平红球菌KB1的生长有明显促进作用,且能促进VBNC状态KB1细胞的复苏,复苏效果随重组Rpf蛋白浓度的增加而更加显著。利用定点突变技术对rpf基因序列溶菌酶活性相关部分氨基酸Asp45,Cys50,Glu51,Thr60,Gln69,Thr74,Trp75和Cys114进行了定点突变,构建了几种不同Rpf氨基酸突变体质粒,在大肠杆菌中诱导表达及Ni琼脂糖亲和层析纯化,发现突变后的Rpf溶菌酶活性发生了不同程度改变,其中C50G+C114T突变体溶菌酶活性丧失了86.68%,D45A+E51K突变体溶菌酶活性丧失了84.43%,Q69K突变体溶菌酶活性丧失86.11%,E51A突变体活性丧失11.14%,而W75V突变体的溶菌酶活性增加了94.45%。Rpf促生长和复苏作用与溶菌酶活性密切相关,C50G+C114T突变体的促生长作用和复苏作用消失,W75V突变体能显著增加红平红球菌细胞生长及非可培养细胞的复苏。将红平红球菌重组Rpf蛋白添加到石油污染土壤样品中,研究了其对土壤中石油降解菌的分离效果,发现添加Rpf能促进土壤中石油降解微生物的分离效果。从添加Rpf的土壤样品新分离出9株石油降解细菌,通过16S rDNA序列分析确定其分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、赖氏菌属（Leifsonia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）。用红外测油仪测定所分离菌株对石油的降解作用,发现芽孢杆菌（Bacillus sp.）JC1、（Bacillus sp.）JD5、（Bacillus sp.）FD1、（Bacillus sp.）JP3和（Bacillus sp.）FP3的降解率为43.94%、41.58%、28.96%、44.38%和29.87%,苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）JP1和（Ochrobactrum sp.）FP1的降解率分别为36.12%和34.27%,微杆菌（Microbacterium sp.）JD2和（Microbacterium sp.）FD2的降解率为26.01%和20.46%。 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 65 |
| URL标识 | 查看原文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/95286]  |
| 专题 | 兰州理工大学 |
| 作者单位 | 兰州理工大学 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 罗旦. 红平红球菌rpf基因突变、生物活性及应用研究[D]. 2019. |
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