| 题名 | 嵌段无序温敏性聚合物载体的合成及其应用研究 |
| 作者 | 李轲 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 导师 | 陈振斌 |
| 关键词 | 载体 青霉素G酰化酶 靶点间距 酶活回收率 微环境 |
| 学位名称 | 硕士 |
| 英文摘要 | 固定化青霉素G酰化酶（Penicillin G acylase,PGA）是一种被广泛应用的工业催化剂,它可以催化青霉素G钾水解,得到产物6-氨基青霉烷酸（6-APA）。6-APA是半合成青霉素类药物的关键中间体,在抗菌消炎等领域占有很大的市场空间。因此,固定化PGA的一些主要性能,如酶活回收率、响应速率、重复使用性等,直接关联着企业的经济成本与效益。而固定化PGA的性能与载体的结构和性质密切相关,因此,设计合成合适的载体是提高固定化PGA性能的一个关键途径。无机、有机和复合材料作为固定化PGA的主要载体类型,尽管它们在固定化PGA的负载量、响应速率、重复使用性和回收率等方面都得到了不同程度的提高,但相关问题并没有根本改善。而且,研究在如何提高酶活回收率方面的进展却更加缓慢。酶活回收率较低的主要原因在于载体微环境不能适宜酶催化活性最高时所对应的构象需求,导致酶活性中心构象的变形。为探究影响酶活回收率的关键微环境因素,同时兼顾固定化PGA负载量、响应速率和重复使用性,本论文设计合成了两种温敏性嵌段无序聚合物作为PGA的固定化载体。通过利用温敏性聚合物溶胶/凝胶相转变过程提升固定化PGA的响应速率和重复使用性;通过设计载体的多羟基微环境提高载体亲水性,进而维持PGA的高催化活性构象;通过调适靶点间距进一步巩固PGA高催化活性构象,进而提升酶活回收率,研究取得了较好成果,现将研究内容及结果总结如下:1)首先采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法,以N,N-二乙基丙烯酰胺（PDEA）和甲基丙烯酸β-羟乙酯（HEMA）为功能单体,合成了二嵌段聚合物PDEA-b-PHEMA,并考察了DEA和HEMA比例对PGA酶活性的影响,得出适宜的DEA和HEMA嵌段比例。之后,探究了在载体制备条件下HEMA和甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的竞聚率。在上述工作的基础上,合成了具有不同靶点间距的温敏性嵌段无序共聚物载体PDEA-b-PHEMA-b-P（HEMA-co-GMA）,并利用核磁氢谱（1HNMR）考察了聚合物的结构及分子量,结果表明,通过1HNMR表征的聚合物中GMA和HEMA摩尔比与通过竞聚率计算结果间的误差范围为1.76-3.47%,凝胶渗透色谱（GPC）表征证明了合成载体的反应为活性/可控自由基聚合。温敏性研究结果表明共聚物载体的低临界相转变温度（LCST）随着无规共聚中单体HEMA的增加而降低;催化性能研究表明固定化PGA响应速率快,且固定化PGA的酶活回收率随靶点间距的增大而增大,当无规共聚物嵌段中HEMA与GMA的摩尔比为8.15:1时(即聚合物PDEA100-b-PHEMA10-b-P(HEMA65-co-GMA8)),固定化PGA的活性回收率可达51.20%,比纯单纯GMA固定化PGA的活性回收率高16.90%。2)改变共聚单体,将无规共聚物中的HEMA改变为甲基丙烯酸甲酯（MMA）,采用相似的方法,制备了嵌段无序聚合物载体PDEA-b-PHEMA-b-P（MMA-co-GMA）,同样,利用核磁氢谱（1HNMR）考察了聚合物的结构及分子量,结果表明,通过1HNMR表征的聚合物中GMA和HEMA摩尔比与通过竞聚率计算结果间的误差范围为1.32-3.71%,凝胶渗透色谱（GPC）表征证明了合成载体的反应为活性/可控自由基聚合。聚合物的LCST随着聚合物中疏水单体MMA的增加而降低;随着靶点间距的增大,固定化PGA的酶活回收率逐渐增大;催化性能研究表明固定化PGA具有媲美于游离PGA的响应速率,且固定化PGA的酶活回收率随靶点间距的增大而增大,当聚合物中MMA与GMA的摩尔比约为8.75:1时(即聚合物PDEA100-b-PHEMA10-b-P(MMA87-co-GMA10)),固定化PGA的酶活回收率可高达63.51%,比PDEA100-b-PHEMA10-b-P(HEMA65-co-GMA8)高12.31%,且比单纯的GMA固定化PGA高出21.70%。最重要的是,根据HEMA和MMA两种单体作为共聚单体时,固定化PGA酶活回收率随靶点间距增大的变化规律可断定当固定化靶点密度较大时,固定化酶分子因相互挤压导致其活性中心构型变形严重是酶活回收率较低的主要原因,同时多点固定也会影响固定化PGA的酶活回收率。3)基于以上两部分的结果,本部分以最佳MMA和GMA摩尔比的聚合物PDEA100-b-PHEMA10-b-P(MMA87-co-GMA10)为载体,对其固定化工艺条件进行了研究。结果表明:当固定化酶液浓度、时间、pH和温度分别为1.0%、16小时、8.0和37oC时,固定化PGA的酶活回收率最高,其值为68.50%。最后,基于优化条件下制备的固定化PGA,本实验对固定化载体的重复使用性及储存稳定性进行了探究,当载体重复使用10次之后,载体回收率为99%,固定化PGA的相对酶活力为94%;储存250天之后,固定化PGA的相对酶活力为92%,表明固定化PGA有优异的重复使用性和储存稳定性。 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 75 |
| URL标识 | 查看原文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/95006]  |
| 专题 | 兰州理工大学 |
| 作者单位 | 兰州理工大学 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李轲. 嵌段无序温敏性聚合物载体的合成及其应用研究[D]. 2019. |
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