| 题名 | 马铃薯Patatin启动子及其前导肽序列在转基因拟南芥中的表达特性研究 |
| 作者 | 张婷 |
| 答辩日期 | 2018 |
| 导师 | 李雪雁 ; 马建忠 |
| 关键词 | Patatin 启动子 信号肽 拟南芥 基因表达 |
| 学位名称 | 硕士 |
| 英文摘要 | Patatin是一组分子量约40 k Da的马铃薯块茎专一性蛋白,通常有糖基化修饰,其含量可占到马铃薯块茎总可溶性蛋白的40%左右。Patatin启动子赋予其编码基因的块茎专一性表达,是一个强启动子。在高浓度蔗糖的诱导下,Patatin启动子也能启动下游基因在马铃薯植株的其它部位表达。早期依据Patatin编码基因的5’-端非翻译区有无插入序列将其分为两大类:Class I在其5’-端非翻译区无22bp的插入序列;Class II在其5’-端非翻译区有22 bp的插入序列。Class I Patatin最初的23个氨基酸残基被推测为其信号肽,但未有实验证明。据此,本实验室前期的研究生构建了Class I Patatin启动子驱动的GUS(p05质粒)和23aa-GUS(p06质粒)载体并对马铃薯进行了遗传转化,但转基因马铃薯的GUS表达信号很弱。对此,我们测试了上述构建在转基因拟南芥中的表达特点,结果如下:1.已有转基因拟南芥植株的分子鉴定及RT-PCR检测转录水平分析。本实验研究生前期将p05质粒转化拟南芥获得2株Pro Patatin::GUS植株,命名为At G-1与At G-2。将p06质粒转化拟南芥获得6株Pro Patatin::23aa-GUS转化株,命名为At SG-1~At SG-6。经PCR扩增及扩增产物测序,上述2株p05质粒转化株系均为p06质粒转化而来,分别更名为At G-1→At SG-7、At G-2→At SG-8(本论文中均使用了更正后的株系名)。RT-PCR检测结果表明,野生型无条带,At SG系列8株转化株都显示出专一条带,其中At SG-1与At SG-3较弱,At SG-2、At SG-4~At SG-8条带较强。说明p06质粒遗传转化获得的8株At SG转基因株系均有GUS基因的表达。2.Pro Patatin::GUS、Pro Patatin::23aa-GUS的重新构建及Pro35s::23aa的构建。为验证Patatin最初的23个氨基酸残基是否为信号肽序列并定位Patatin的亚细胞部位,我们双酶切Pro Patatin::GUS、Pro Patatin::23aa-GUS载体获得了Pro Patatin和Pro Patatin::23aa两个DNA片段,又扩增出Pro35s::23aa DNA片段,插入至含有GFP基因的植物遗传转化载体p CAMBIA-1304。重组质粒p1304-Gus、p1304-SGus和p1304-SP经测序核实分别插入了Pro Patatin、Pro Patatin::23aa和Pro35s::23aa,即形成了新的重组片段Pro Patatin::GFP-GUS、Pro Patatin::23aa-GFP-GUS和Pro35s::23aa-GFP-GUS。3.转基因拟南芥At SG植株GUS基因表达的蛋白水平分析。分别选取哥伦比亚野生型、转基因At SG-2与At SG-7株系受高糖诱导生长13天的幼苗,各自称重70 mg,蛋白简易提取法粗提蛋白。一抗使用美国Sigma公司小鼠抗His-tag单克隆抗体(YB30401ES10),二抗使用碧云天生物公司辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠Ig G(H+L)(A2016)单克隆抗体。Western Blotting结果显示两条清晰的蛋白带,分子量分别在65~70KD、70~75KD之间,与理论上切割/未切割信号肽后含组氨酸标签GUS蛋白分子量69.5KD、72.2KD相符。认为可能是信号肽在参与跨膜运输时会被切割,从而产生两条不同分子量的条带,一条为切割前的分子量条带,一条为切割了信号肽后的分子量条带。4.转基因拟南芥At SG植株GUS基因表达的时空特性分析。对转基因拟南芥植株At SG-2株系进行全生长发育期GUS组织化学染色。分别取种子、萌发的种子、生长7天的幼苗、生长13天的幼苗、花、果荚进行染色。结果表明:At SG-2植株中GUS基因在种子中全部表达,在种子萌发期间不再表达,在生长7天和13天的幼苗中不表达,在花器官中有微弱表达,主要表达在花柱、花瓣和花柄中,在果荚中不表达。5.高浓度蔗糖对转基因拟南芥At SG植株GUS基因表达的影响。已知Patatin启动子在马铃薯中受高浓度蔗糖的诱导。将Patatin启动子驱动的GUS基因转入拟南芥,使用8%蔗糖进行诱导。取高糖诱导的At SG-2株系种子、萌发的种子、生长7天的幼苗、生长13天的幼苗、花、果荚进行染色。结果表明:种子时期在子叶和胚根中全部表达GUS基因,萌发的种子中表达微弱,只在下胚轴中表达。在生长7天的幼苗中子叶,胚柄,根均有表达,胚柄表达最为强烈。在生长13天的幼苗中,子叶、胚柄及叶脉处表达最强烈。在花器官中均有表达,花柱和花瓣处表达最强烈。在果荚中均有表达。 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 71 |
| URL标识 | 查看原文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/94403]  |
| 专题 | 兰州理工大学 |
| 作者单位 | 兰州理工大学 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张婷. 马铃薯Patatin启动子及其前导肽序列在转基因拟南芥中的表达特性研究[D]. 2018. |
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