干细胞是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的早期未分化细胞，在特定条件下可分化成不同的功能细胞，形成组织和器官。胚胎干细胞（ESCs）是可以在体内外分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞的多潜能干细胞，既可作为细胞分化和发育调控机制的体外研究模型，亦可用作细胞治疗及组织器官构建的种子细胞，使其成为研究的热点。模拟体内ESCs 生长微环境中化学、物理因素，可探究其对ESCs 定向分化的影响，提升分化效率和细胞成熟度。无机纳米粒子硅酸钙（CS），已被证实能够促进间充质干细胞的成骨向分化，但其对人ESCs（hESCs）的分化（尤其是肝向分化）是否具有调控作用还鲜有研究；基底硬度作为典型的生理力学调控因素，对hESCs 分化调控的作用亦不明朗。因此本文从细胞生长的生物化学因素（CS 浸出液）及基于生理病理的力学微环境（基底硬度）两方面分别探究hESCs 的定向分化，分述如下：

1. CS 浸出液对hESCs 肝向分化的影响

在优化的hESCs（H9细胞系）分化诱导方案，即干性维持阶段（STEM）→定型内胚层阶段（DE）→前体肝细胞阶段（Pre-H）→成熟肝细胞阶段（M-H），的不同阶段，分别加入高（1/64）、低（1/256）两种不同稀释浓度CS浸出液，研究hESCs不同分化阶段对CS添加顺序和浓度的依赖性。结果表明，分化的前两个阶段，高浓度浸出液可迅速启动分化，而低浓度浸出液则有利于持续性的DE 向分化。基于此，筛选出hESCs 肝向分化的四个阶段最适的CS 添加方式及浓度组合条件，所得到的肝细胞能显著改善CCl₄ 注射小鼠的早期肝纤维化症状。上述研究揭示了CS 浸出液浓度与作用阶段对hESCs 肝向分化的贡献，确定CS 促分化的最适添加条件，验证了所获得的肝细胞对疾病模型的治疗作用。

2. 基底-细胞间粘附影响hESCs 的DE 向分化机制

基底-细胞间粘附是hESCs（H1 细胞系）维持干性和启动分化的重要力学因素。使用硬度可调的聚丙烯酰胺水凝胶、制备了可模拟生理/病理条件下肝脏硬度的三种基底（0.14 kPa、6.1 kPa、46.7 kPa），将接种于其上的H1细胞系定向诱导分化为DE 细胞。结果表明，随着硬度的增加，DE 分化标志物增加，基底-细胞间β₁-integrin、粘着斑组成蛋白vinculin、磷酸化FAK 的表达量增加、细胞受到基底的牵引力变大，力学敏感蛋白YAP 的活化入核比例升高。阻断β₁-integrin 后DE 分化减弱、解聚F-actin 纤维、或使用YAP小分子抑制剂，均可促进YAP 活化、增强hESCs 的DE 向分化。硬基底可增强YAP 活化并入核、进而促进H1分化为DE 细胞；在ESCs 的DE 向分化过程中不同硬度基底上细胞所受牵引力与YAP 活化呈现正相关。上述研究深化了对基底硬度调控ESCs 向DE 细胞分化的生物力学机制的认识。

综上，本文通过CS 浸出液和基底硬度对胚胎干细胞H9/H1 细胞系肝向分化进行调控的研究，证实了CS 能够促进ESCs 体外肝向分化，验证了基底硬度通过β₁-整合素调控细胞牵引力、并影响干细胞分化这一作用机制，揭示了YAP 活化对ESCs 向DE 细胞分化的促进作用及YAP 活化与牵引力之间的正相关关系。以上研究丰富了对ESCs 肝向分化的力学-化学-生物学耦合规律的认识。

干细胞是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的早期未分化细胞，在特定条件下可分化成不同的功能细胞，形成组织和器官。胚胎干细胞（ESCs）是可以在体内外分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞的多潜能干细胞，既可作为细胞分化和发育调控机制的体外研究模型，亦可用作细胞治疗及组织器官构建的种子细胞，使其成为研究的热点。模拟体内ESCs 生长微环境中化学、物理因素，可探究其对ESCs 定向分化的影响，提升分化效率和细胞成熟度。无机纳米粒子硅酸钙（CS），已被证实能够促进间充质干细胞的成骨向分化，但其对人ESCs（hESCs）的分化（尤其是肝向分化）是否具有调控作用还鲜有研究；基底硬度作为典型的生理力学调控因素，对hESCs 分化调控的作用亦不明朗。因此本文从细胞生长的生物化学因素（CS 浸出液）及基于生理病理的力学微环境（基底硬度）两方面分别探究hESCs 的定向分化，分述如下：

1. CS 浸出液对hESCs 肝向分化的影响

在优化的hESCs（H9细胞系）分化诱导方案，即干性维持阶段（STEM）→定型内胚层阶段（DE）→前体肝细胞阶段（Pre-H）→成熟肝细胞阶段（M-H），的不同阶段，分别加入高（1/64）、低（1/256）两种不同稀释浓度CS浸出液，研究hESCs不同分化阶段对CS添加顺序和浓度的依赖性。结果表明，分化的前两个阶段，高浓度浸出液可迅速启动分化，而低浓度浸出液则有利于持续性的DE 向分化。基于此，筛选出hESCs 肝向分化的四个阶段最适的CS 添加方式及浓度组合条件，所得到的肝细胞能显著改善CCl₄ 注射小鼠的早期肝纤维化症状。上述研究揭示了CS 浸出液浓度与作用阶段对hESCs 肝向分化的贡献，确定CS 促分化的最适添加条件，验证了所获得的肝细胞对疾病模型的治疗作用。

2. 基底-细胞间粘附影响hESCs 的DE 向分化机制

基底-细胞间粘附是hESCs（H1 细胞系）维持干性和启动分化的重要力学因素。使用硬度可调的聚丙烯酰胺水凝胶、制备了可模拟生理/病理条件下肝脏硬度的三种基底（0.14 kPa、6.1 kPa、46.7 kPa），将接种于其上的H1细胞系定向诱导分化为DE 细胞。结果表明，随着硬度的增加，DE 分化标志物增加，基底-细胞间β₁-integrin、粘着斑组成蛋白vinculin、磷酸化FAK 的表达量增加、细胞受到基底的牵引力变大，力学敏感蛋白YAP 的活化入核比例升高。阻断β₁-integrin 后DE 分化减弱、解聚F-actin 纤维、或使用YAP小分子抑制剂，均可促进YAP 活化、增强hESCs 的DE 向分化。硬基底可增强YAP 活化并入核、进而促进H1分化为DE 细胞；在ESCs 的DE 向分化过程中不同硬度基底上细胞所受牵引力与YAP 活化呈现正相关。上述研究深化了对基底硬度调控ESCs 向DE 细胞分化的生物力学机制的认识。

综上，本文通过CS 浸出液和基底硬度对胚胎干细胞H9/H1 细胞系肝向分化进行调控的研究，证实了CS 能够促进ESCs 体外肝向分化，验证了基底硬度通过β₁-整合素调控细胞牵引力、并影响干细胞分化这一作用机制，揭示了YAP 活化对ESCs 向DE 细胞分化的促进作用及YAP 活化与牵引力之间的正相关关系。以上研究丰富了对ESCs 肝向分化的力学-化学-生物学耦合规律的认识。