动物类中药是中国传统药学的重要组成部分，其中动物骨骼和骨髓具有悠久的药用历史，记载于《本草纲目》、《中药大辞典》、《白地依药书》等。新疆作为畜牧业大省，动物骨髓来源丰富，疆内医院使用动物骨髓为原料的制剂由来已久，具有祛风止痛、消炎退肿、软筋松肌等作用，治疗骨折僵硬、关节炎、风湿等疾病药效较好。但现有制备方法陈旧，有效部位产率低，活性弱，特征成分至今尚未明确，质量控制不规范。因此，本文将新疆地产羊、牛、马和骆驼腿骨骨髓为研究对象，对其中的蛋白、多肽、氨基酸、油脂与微量元素等成分展开系统的分离分析及活性研究，为动物骨髓资源的有效利用提供科学依据。一、骨髓蛋白和多肽的制备与鉴定1）牛骨髓蛋白提取方法的筛选：以牛骨髓蛋白含量、提取率和抗菌活性作为指标，对10种不同提取方法进行了比较研究。结果显示，水、0.5 mol/L NaCl和Tris-HCl溶液为理想提取溶剂，其蛋白含量分别为52.20 ± 0.58 mg/mL，50.19 ± 0.21 mg/mL，43.21 ± 0.05 mg/mL。进一步LC/MS分析得出，0.5 mol/L NaCl提取部位主峰约含有33种多肽段，带电荷的多肽数量多于其他部位，适合于进一步分离分析。2）牛骨髓蛋白提取方法优化及超滤膜富集工艺研究：通过单因素和正交试验优化了NaCl提取工艺，最佳提取条件为：NaCl浓度0.5 mol/L，提取次数2次，提取温度45℃，提取时间3 h，提取率为55.3%，蛋白含量达56.7 mg/mL。采用响应面法优化超滤膜富集工艺，最佳参数为：10 kDa载留膜，操作压力0.2 MPa，浓缩倍数5倍，温度40 ℃，膜通量达25.29 L /(m2.h)。该方法得到的蛋白质含量提高至76.9 mg/mL。3）牛骨髓多肽肽段的鉴定：选用上述方法制备的牛骨髓水提蛋白、0.5 mol/L NaCl提取液超滤膜分离部位和葡聚糖凝胶纯化部位，通过二维电泳技术进行分离，并用MALDI-TOF-TOF等技术确定多肽段分子量和氨基酸序列。共鉴定20种具有活性多肽段，其中抗氧化肽10种，抗菌肽7种，降压肽3种。4）三种骨髓蛋白的提取与分离分析：以上述研究基础上，采用上述最佳三种提取方法对骨髓蛋白进行制备，筛选最佳提取部位，并进行抗菌、抗氧化活性筛选。结果显示，水提法蛋白提取率为：马骨髓＞羊骨髓＞骆驼骨髓；硫酸铵分级沉淀法中30%马骨髓部位蛋白提取率最高。0.5 mol/L NaCl提和膜分离中，骆驼骨髓蛋白10 kDa载留部位含量最高（72.63 mg/mL）。FT-IR分析显示3种骨髓水提蛋白二级结构以α-螺旋为主。SEM分析表明三种骨髓水提蛋白均有特定的表面结构。抗氧化结果表明，水提物中马和牛骨髓蛋白抗氧化能力较高，IC50值分别为0.573和0.834 mg/mL。二、 四种动物骨髓营养成分评价1）四种动物骨髓氨基酸组成分析：分别制备骨髓粉末和骨髓蛋白并评价水解氨基酸组成。结果显示均含有17种氨基酸，骨髓蛋白氨基酸种类比较齐全，药用氨基酸含量变幅为158.93-293.84 mg/g。氨基酸总量排序为：马骨髓蛋白>牛骨髓蛋白>羊骨髓蛋白>骆驼骨髓蛋白。马骨髓蛋白中人体必需氨基酸/氨基酸总量比例较接近于世界粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）提出的理想氨基酸标准。2）四种动物骨髓常微量元素分析：分别测定骨髓粉末和骨髓蛋白中常微量元素含量。结果得出，骨髓蛋白中常微量元素含量高于骨髓粉末；四种骨髓蛋白中Na、K、Ca、P和Mg等5种常量元素的总含量排序为：马骨髓蛋白>骆驼骨髓蛋白>牛骨髓蛋白>羊骨髓蛋白。马骨髓蛋白中必须微量元素含量最丰富，其中Ca、P含量分别达24.92 mg/g、10.83 mg/g。3）四种动物骨髓油不饱和脂肪酸的富集与活性比较：采用四种溶剂（正己烷、石油醚、无水甲醇和无水乙醇）对牛骨髓油进行提取、分析。结果表明，正己烷提取效果最好，饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸（SFA/UFA）比例为1/1.41。四种骨髓粉末经正己烷提取后，SFA/UFA比例分别为1/1.417、1/1.327、1/1.912、1.285/1；经尿素包合后，SFA/UFA分别提高至1/1.518、 1/1.390、 1/2.037、 1.216/1；经冷冻结晶后，SFA/UFA分别提高至1/1.920、1/2.141、1/2.360、1/1.157。冷冻结晶法能有效地富集不饱和脂肪酸，富集后抗菌和抗氧化活性均增强。三、马骨髓复方制剂成分与初步药理作用研究1）选用马骨髓为基质，制备复方制剂，测定其油脂、多糖、蛋白、常微量元素含量，分析其改善新西兰大白兔左膝关节挛缩模型的药理活性。结果表明，马骨髓复方含油率60-66%，SFA/UFA比例为1/1.71，其中不饱和脂肪酸含量达63.14%。抗氧化活性结果显示，马骨髓复方清除自由基能力较强。2）建立新西兰大白兔左膝关节挛缩模型，将复方药涂抹4周后，与原药相比，复方药组关节活动度（Range of Motion）、股动脉收缩期峰值血流速度(Peak systolic blood flow velocity，PS)和舒张末期血流速度（End diastolic blood flow velocity，ED）均有统计学差异（P<0.05）。马骨髓复方改善关节挛缩模型效果比原药好。