黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）是指由黄曲霉及寄生曲霉产生的次级代谢产物。AFB1是一类毒性极强的真菌毒素，具有严重的致畸、致癌、致突变作用。国际癌症研究机构已经将AFB1列为I类致癌物。AFB1的污染广泛存在于多种农产品的生长，加工，储藏及运输等各个阶段。世界各国每年因AFB1污染而造成的粮食和经济损失十分严重。当人体食用受AFB1污染的食品后，AFB1可直接在人体内产生毒性效应，危害人体健康。因此，AFB1的灵敏检测对保障食品安全、生态环境和人类健康具有十分重要的意义。传统的AFB1检测方法，如高效液相色谱法，薄层色谱法和酶联免疫分析等，存在操作步骤繁琐，样品前处理复杂，或抗体制备困难，稳定性差等不足。核酸适配体是指通过指数富集系统进化技术（systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX）筛选得到的，能够与靶分子特异性结合的一段DNA或RNA。与抗体相比，适配体具有可人工合成，稳定性高，易实现功能化修饰与标记，与靶分子结合后，构象改变等特点，在传感分析应用中更具优势。基于以上研究背景，本论文以可识别AFB1的核酸适配体作为亲和配体，系统表征了适配体的亲和性能，并发展了多种简单，快速，灵敏传感分析AFB1的新方法，主要研究内容包括以下几点：
       （1）以特定位点四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TMR）标记的适配体为探针，采用荧光各向异性分析（fluorescence anisotropy，FA）技术系统表征了适配体的亲和性能，测定了适配体的亲和力，考察了适配体的结合位点及适配体对AFB1的选择性。TMR标记的适配体与AFB1结合后，构象发生变化，导致TMR与G碱基之间的相互作用发生变化，引起TMR的局部转动受到影响，因而，适配体探针的荧光各向异性值发生改变。根据适配体探针与AFB1结合前后，荧光各向异性值的变化，我们筛选出当TMR标记在含50个碱基的适配体（A50）的T26位点时，其对AFB1的FA响应更灵敏。当适配体被截短为只含26个碱基（A26）时，其与AFB1仍保持较高的亲和力。A50与A26适配体均为简单的茎环结构，茎环结构的稳定性对适配体与AFB1的结合影响较大。环状部位可能是适配体与AFB1的结合位点。适配体与AFB1，AFB2，AFM1，AFM2，AFG1，AFG2的交叉反应率分别为100%, 61%, 23%, 21%, 6.3%, 6.5%。等温量热滴定分析也证实了适配体的亲和性能。圆二色光谱分析表明适配体与AFB1结合后的构象变化。适配体的亲和性能研究是构建基于适配体的AFB1传感分析方法的基础。
      （2）在研究内容（1）的基础上，以TMR标记的适配体为探针，发展了一种直接模式的荧光各向异性分析法，检测AFB1。我们详细考察了影响适配体与AFB1结合的因素，包括MgCl2浓度，pH，温度，缓冲溶液等。实验发现，缓冲溶液中MgCl2对适配体与AFB1的结合十分关键。在优化的实验条件下，实现了对AFB1的灵敏检测。AFB1的检出限是2 nM，检测范围是2 nM～1 μM。适配体对其他几类常见的真菌毒素（赭曲霉素A，赭曲霉素B，玉米赤霉烯酮，伏马毒素B1及伏马毒素B2）无响应。本方法能够实现多种复杂基质（包括稀释的人血清，尿样，啤酒和红酒样品）中AFB1的检测，玉米面粉中AFB1的回收率为82%～117%。本方法在均相溶液中直接检测AFB1，无需分离，操作简单，成本低廉，仅需要荧光染料标记的适配体为探针，在实际样品的分析中具有较大的应用潜力。
      （3）发展了一种基于毛细管阵列式荧光扫描分析检测AFB1的方法。在特定位点的T碱基上标记荧光素（fluorescein, FAM）的适配体探针与AFB1结合后，荧光强度显著增加。通过采用毛细管阵列式荧光扫描分析，16个AFB1样品的荧光检测仅需1 min，每个AFB1样品的用量仅需4～5 μL。AFB1的检出限可达0.5 nM。本方法操作简单，检测快速，所需样品量较少，适合AFB1的快速和高通量分析检测。
      （4）建立了一种基于适配体的直接模式的表面等离子体共振分析法（surface plasma resonance，SPR），用于AFB1的检测。适配体被固定在传感芯片表面，用于特异性识别AFB1。适配体与AFB1结合后，SPR信号增大，当缓冲液流过芯片表面时，AFB1解离，导致SPR信号下降。SPR分析实验中，适配体与AFB1的反应是快结合和快解离的过程，适配体芯片无需特殊的再生溶液就可以再生。SPR分析表征出了适配体结合AFB1的动力学参数，测定得到适配体与AFB1的解离常数为12 nM。本方法对AFB1的检出限可达0.4 nM，能够实现对稀释的啤酒和红酒样品中AFB1的检测。所发展的SPR方法简单，检测快速，灵敏度高，适配体修饰的SPR芯片稳定性高，可重复利用。
       （5）基于AFB1与互补DNA（cDNA）竞争结合适配体，发展了一种MgCl2介导的激光诱导荧光-毛细管电泳（capillary electrophoresis-laser induced fluorescence，CE-LIF）检测AFB1的方法。样品溶液中不含AFB1时，FAM标记的适配体探针与cDNA杂交形成双链DNA。在含有2 mM MgCl2的分离缓冲液中，双链DNA与单链适配体探针可以被CE分离，呈现出两个尖锐的峰。当样品溶液中加入AFB1后，适配体与AFB1结合，导致双链DNA解离。因而，CE图谱中，双链DNA的峰面积下降，单链适配体的峰面积增大。依据探针峰面积的变化，我们实现了对AFB1的定量检测。在实验条件中，cDNA的长度，适配体与cDNA的比例，及样品缓冲液和分离缓冲液中MgCl2的浓度对AFB1的灵敏检测影响较大。在优化的实验条件下，本方法对AFB1的检出限为0.5 nM。这种基于MgCl2介导的CE-LIF分析方法具有简单，快速，灵敏度高，及样品消耗量少等优势。
      （6）结合酶反应的信号放大技术，发展了一种基于辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）联适配体竞争分析AFB1的方法。固定在微孔板表面的BSA-AFB1偶联物与样品溶液中的AFB1竞争结合HRP酶联适配体探针。与BSA-AFB1结合的HRP酶联探针催化底物产生检测信号。随着AFB1的加入，微孔板表面结合的HRP减少，导致信号降低。根据信号的变化可以对AFB1进行检测。当采用HRP酶的生色底物（TMB）时，AFB1的检出限是0.2 nM，检测范围是0.2 nM～200 nM。吸光度分析所需仪器简单，较易实现。当采用化学发光底物时，AFB1的检出限降低到0.01 nM，检测范围扩大到0.01～100 nM。本方法能够实现对稀释的白酒和玉米面粉样品中AFB1的检测，具有实际应用潜力。本方法结合了HRP酶反应的信号放大，检测灵敏度高，适合于AFB1的高通量分析检测。