甲壳素是储存量仅次于纤维素的天然海洋生物多糖，来源广泛。而壳聚糖是 甲壳素脱乙酰的产物，具有许多优良的生物特性，如天然无毒、生物相容性好、 抗病毒、免疫调节作用等。但其在水中的不溶性限制了其发展。而将壳聚糖进行 改性，在其链上引入新活性基团是提高壳聚糖水溶性，改善生物活性的有效手段 之一。在诸多衍生物中，季铵化可以增加壳聚糖的正电性、提高水溶性和生物活 性而备受关注。 课题组前期对壳聚糖季铵盐的免疫活性进行了研究，发现低分子量较高分子 量的壳聚糖季铵盐免疫活性高，而且可以激活 RAW264.7 细胞中的 MAPK， JAK/STAT 和 PI3K/Akt 通路，调节免疫应答。并发现将壳聚糖季铵盐制备成纳 米粒后能显著提高鸡体内的细胞免疫和体液免疫，具有更强的免疫刺激活性，可 将其开发为免疫增强剂。而壳聚糖季铵盐的季铵基团的取代度是影响其活性的重 要指标之一，但目前没有相关的报道证明多大的取代度能达到最佳的免疫效果。 因此，我们制备了不同取代度的壳聚糖季铵盐，筛选免疫活性最佳的取代度，然 后将该样品制备成负载牛血清白蛋白的纳米粒，研究其免疫活性作用，为完善壳 聚糖季铵盐在免疫增强剂的开发方面提供较全面的理论基础。本文的具体研究结 果如下：

1.成功制备了 6 种不同取代度的含乙酰基壳聚糖季铵盐(HACC)和全脱乙酰 壳聚糖季铵盐(De-HACC)，并以 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞为模型，进行免疫活 性的筛选。结果表明，乙酰基显著影响壳聚糖季铵盐的取代度，脱去乙酰基后， 可以得到 71%的高取代度；细胞毒性测试表明在适当浓度范围内所有取代度的壳 聚糖季铵盐均安全无毒；采用 Griess 法测定了一氧化氮(NO)的表达量，荧光定 量 PCR 技术测定了 IL-6 和 TNF-α的 mRNA 表达，发现季铵化程度和乙酰基显著 影响 NO 和细胞因子的表达量，对于不脱乙酰基的壳聚糖季铵化后，30%-HACC 的免疫效果优于 13%-HACC 和 23%-HACC，而全脱乙酰的壳聚糖季铵化后， 54%-De-HACC 的免疫效果优于 62%-De-HACC 和 71%-De-HACC；Caco-2 细胞 不同取代度壳聚糖季铵盐的制备及其对免疫活性的影响 II 对 54%- De-HACC 摄取量高于 30%-HACC。

2. 采 用 离 子 交 联 法 ， 三 聚 磷 酸 钠 为 交 联 剂 ， 分 别 以 30%-HACC 和 54%-De-HACC 为载体包裹牛血清白蛋白，制备了载牛血清白蛋白纳米粒，并对 其进行理化性质表征以及免疫活性测定。结果表明：得到的两种纳米粒粒径为 100 nm 左右，Zeta 电位为+10 mV 左右，具有良好的生物相容性；透射电镜显 示纳米粒成光滑球状结构；聚集性表明 54%-全脱乙酰壳聚糖季铵盐纳米粒 (54%-De-HACC-Nps) 稳 定 性 要 高 于 30%- 含 乙 酰 基 壳 聚 糖 季 铵 盐 纳 米 粒 (30%-HACC-Nps)；且 54%-De-HACC-NPs 对 NO、IL-6 和 TNF-α的表达水平及 被 Caco-2 细胞的摄取均高于 30%-HACC-NPs，说明 54%-De-HACC-NPs 免疫活 性较强。

综上所述，我们证实了取代度在影响壳聚糖季铵盐免疫调节中的重要作用， 为之后壳聚糖季铵盐作为免疫增强剂的开发与应用提供参考。