牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国重要的水产养殖鱼类，易受多种鱼类病原体包括迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，E. tarda）的感染。E. tarda是一种宿主范围广泛的革兰氏阴性菌。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为21-23个核苷酸的单链非编码RNA，在转录后水平通过负调控靶基因的表达，参与多个细胞生物学过程的调节，包括病原感染、细胞自噬和细胞凋亡。在本论文研究中，我们采用高通量测序技术，研究了E. tarda在感染牙鲆后不同时间点，牙鲆肾脏miRNAs的表达情况。共有96个牙鲆miRNAs的表达在感染E. tarda后显示显著性差异，并被命名为DEmiRNAs（Differentially Expressed miRNAs）。针对这96个DEmiRNAs进行了靶基因预测分析，共发现2779个潜在靶基因。靶基因的富集分析显示，这2779个预测靶基因与多种生物过程、细胞组分和分子功能相关，并调控多条涉及免疫的通路。
从上述96个DEmiRNAs中，我们挑选了四个差异倍数大或表达量丰富的DEmiRNAs，分别为pol-miR-182-5p、pol-miR-novel_171、pol-miR-novel_547和pol-miR-novel_395，研究了其对靶基因的调控机制以及在E. tarda感染过程中的调控功能。
1、对于pol-miR-182-5p，我们发现其靶基因是S1PR1（sphingosine-1-phosphate receptor 1）。pol-miR-182-5p通过与牙鲆S1PR1（PoS1PR1）的3′UTR之间的特异性结合负调控PoS1PR1。过量表达pol-miR-182-5p显著促进牙鲆细胞凋亡，抑制细胞增殖。在牙鲆体内干扰PoS1PR1表达能增强E. tarda在鱼体组织中的侵袭和传播。
2、对于pol-miR-novel_171，我们发现其表达受E. tarda和细胞肿大病毒（megalocytivirus）RBIV-C1感染的影响。研究发现FAM49B（family with sequence similarity 49 member B）是pol-miR-novel_171的靶基因，并受后者负调控。mRNA表达分析表明，牙鲆FAM49B（PoFAM49B）在多个组织中表达。重组的PoFAM49B蛋白（rPoFAM49B）能够与革兰氏阴性菌相互作用并抑制E. tarda和荧光假单胞菌的生长。在牙鲆细胞中干扰PoFAM49B表达能促进E. tarda在胞内的复制，过量表达pol-miR-novel_171对E. tarda的胞内复制也有类似的影响。同样，在牙鲆体内干扰PoFAM49B表达增强E. tarda在鱼体组织中的传播。此外，在牙鲆细胞中干扰PoFAM49B表达或过量表达pol-miR-novel_171促进细胞凋亡，而在体内和体外干扰PoFAM49B表达可提高促凋亡基因的表达。
3、对于pol-miR-novel_547，我们发现其靶基因是PTEN（phosphatase and tensin homolog）。pol-miR-novel_547在mRNA和蛋白水平均抑制牙鲆PTEN（PoPTEN）的表达。E. tarda和RBIV-C1感染均调控pol-miR-novel_547和PoPTEN的表达。在牙鲆细胞中干扰PoPTEN表达或过量表达pol-miR-novel_547，都显著促进E. tarda的侵袭。同样，在牙鲆体内干扰PoPTEN表达能增强E. tarda的感染，而在体内过量表达PoPTEN则削弱了细菌的感染，但促进了RBIV-C1的复制。进一步的研究表明，PoPTEN通过AKT/mTOR通路影响自噬激活，并调节细胞凋亡。
4、对于pol-miR-novel_395，我们发现其靶向PUF60（poly(U)-binding-splicing factor 60 kDa）。pol-miR-novel_395和牙鲆PUF60（PoPUF60）的表达均受E. tarda和RBIV-C1感染调控。E. tarda感染上调PoPUF60表达，而RBIV-C1感染下调PoPUF60表达。干扰PoPUF60或过表达pol-miR-novel_395显著增强E. tarda在牙鲆细胞中的复制。同样，在牙鲆体内干扰PoPUF60可以促进细菌在牙鲆组织中的传播，但阻滞RBIV-C1的复制；然而，在牙鲆体内过表达PoPUF60显著抑制细菌的传播，但促进病毒复制。
综上所述，我们首次鉴定了E. tarda诱导的牙鲆肾脏miRNAs的表达图谱，揭示了pol-miR-182-5p、pol-miR-novel_171、pol-miR-novel_547和pol-miR-novel_395的调控机制，以及在病原感染、细胞自噬和细胞凋亡中的作用。这些结果为miRNAs介导的牙鲆抗菌免疫研究提供了新的见解。 | 
修改评论