| 题名 | Burkholderia xenovorans LB400联苯双加氧酶及突变体对DDT的降解机制研究 |
| 作者 | 孙成成 |
| 答辩日期 | 2021-05 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 中国科学院烟台海岸带研究所 |
| 导师 | 胡晓珂 |
| 关键词 | DDT 联苯双加氧酶 Burkholderia xenovorans LB400 立体特异性 酶催化 DDT Polychlorinated biphenyls Burkholderia xenovorans LB400 Stereospecificity Enzyme catalysis |
| 学位名称 | 工程硕士 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 英文摘要 | DDT（Dichlorodiphenyltrichloroethane，1，1，1-三氯-二氯二苯基乙烷）是一种典型的持久性有机污染物，曾在疟疾防治和农业除虫方面被广泛应用。虽然包括我国在内的很多国家已经禁止使用DDT，但目前对环境中DDT的检测发现它仍然广泛存在且具有新的输入源。DDT的持续存在对近海生态系统和人类健康具有一定危害，因此它所造成的环境污染问题仍然值得关注。DDT及其脱氯产物在自然条件下极难分解原因之一在于缺乏有效的酶降解系统。目前很少发现可以将DDT完全矿化的降解酶系。由于DDT与多氯联苯等芳香化合物结构类似，随着可以降解DDT的多氯联苯降解菌被发现，联苯双加氧酶（Biphenyl dioxygenase，BPDO）也成为了DDT降解酶系的重要补充。但是，目前有关联苯双加氧酶降解DDT的研究较少。因此，本研究选取了多氯联苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）降解模式菌株Burkholderia xenovorans LB400的联苯双加氧酶作为研究对象，试图探讨联苯双加氧酶对DDT的降解特性及机制。之前的许多研究表明，底物范围和区域特异性主要由联苯双加氧酶末端氧化酶α亚基C末端的残基决定，总共分为4个区域。有学者对Ⅲ、Ⅳ区域氨基酸的功能进行了研究，但目前对Ⅰ、Ⅱ区域氨基酸残基功能研究较少。 本研究以BphAELB400（Biphenyl dioxygenase terminal oxidase of Burkholderia xenovorans LB400，Burkholderia xenovorans LB400联苯双加氧酶末端氧化酶）为亲本，通过晶体结构解析确定位于酶催化口袋入口处Ⅱ区域的283位氨基酸为影响BphAELB400与DDT结合的关键氨基酸残基，将BphAELB400 283位的Ser突变为Met，获得了酶突变体BphAES283M。通过比较BphAELB400和BphAES283M分别以p,p’-DDT和o,p’-DDT为底物时的代谢产物、酶动力学参数、结构分析以及分子对接分析，试图探讨联苯双加氧酶对DDT的催化机理，并以此提高BphAELB400的底物范围和对DDT的催化代谢能力。同时为如何扩大其他BPDO的底物范围和提高降解率的机制研究奠定理论基础。主要研究内容和结论如下： （1）通过对联苯双加氧酶的序列和晶体分析计算发现，280-287片段B值很高，说明该片段具有较高的柔性即在底物结合过程中可以发生构象的改变，同时283位氨基酸残基的突变可以改变283位氨基酸本身以及催化口袋内其他氨基酸与DDT间的作用力。因此，结合其他联苯双加氧酶的比对，对该位点进行突变，构建了pET14b[LB400-S283M-bphAE]，并转化至Escherichia coli C41中，诱导表达，成功获得了目标蛋白BphAES283M。 （2）生理生化数据表明BphAELB400和突变体BphAES283M都无法降解对位的p,p’-DDT，但突变体BphAES283M可以代谢o,p’-DDT并产生2个立体异构体（BphAELB400未观察到相应代谢产物）。稳态动力学数据表明，经Ser283Met替换的突变体Km值约为4.6 µmol/L，kcat值为0.1/s，整体kcat/Km为24.3 L/（µmol∙s），说明突变体与DDT间的结合能力增强，并实现了催化效率的突破。同时，也对实验室保有的其他Ⅲ、Ⅳ区域氨基酸突变的突变体进行了DDT的降解特征实验，未观察到代谢产物和稳态动力学数据。这意味着处于柔性片段上的Ser283Met突变是催化腔匹配DDT分子构象的关键，对于联苯双加氧酶催化其他空间构象较大化合物2，3位的双氧化具有重要意义。 （3）结构分析发现Ser283Met可以扩大催化腔体积，并使催化腔内DDT的空间朝向发生改变。BphAE催化中心包括Met231、Tyr232、Gln226、Phe227、Gln322、His323等氨基酸残基，同时蛋白表面有多处负电势位点。BphAES283M的催化活性空腔体积增大，这很可能有助于BphAES283M与DDT的有效结合。BphAELB400和BphAES283M都无法降解p,p’-DDT的原因可能与其对称结构和对位氯原子的空间构象有关，在分子对接实验中p,p’-DDT反应环始终无法对接到有效结合的位置。苯环上的氯原子影响了2，3位的羟基化反应，这使得BphAELB400仍然无法降解o,p’-DDT；Ser283Met突变使得反应环的两个邻近碳原子与单核铁原子催化中心处于反应距离当中，从而实现2，3位的氧化。最后，残基267和残基247-260组成的片段对于确定对DDT的立体特异性至关重要，但这些残基的作用机制有待进一步探索。对于与BphAELB400结构特征相似的DDT降解酶以及联苯双加氧酶，结合晶体结构解析将其Ⅱ区域关键氨基酸残基如283位点进行定点突变或将是进一步增强其对DDT催化活性的有效策略。 |
| 语种 | 中文 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/29344]  |
| 专题 | 烟台海岸带研究所_中科院烟台海岸带研究所知识产出 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 孙成成. Burkholderia xenovorans LB400联苯双加氧酶及突变体对DDT的降解机制研究[D]. 中国科学院烟台海岸带研究所. 中国科学院大学. 2021. |
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