| 题名 | 化学发光酶免疫分析方法研究和应用 |
| 作者 | 赵利霞 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2005-06-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 林金明 |
| 关键词 | 化学发光酶免疫分析 微板式磁性分离器 白蛋白 雌二醇 人绒毛 膜促性腺激素 chemiluminescence enzyme immunoassay micro-plate magnetic separator human chorionic gonadotropin (HCG) albumin 17β-estradiol (E2). |
| 其他题名 | Development of Chemiluminescence Enzyme Immunoassay Methods |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 免疫分析具有灵敏度高、线性范围宽、可实现全自动化等优点，在生命、环境科学领域得到了广泛的应用。它主要包括放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析以及化学发光免疫分析等方法。在各种不同免疫分析系统发展历程中，都有着方法、仪器、试剂三位一体的特定要求。目前，建立和研究高效的化学发光免疫分析系统已成为人们感兴趣的研究内容之一。本论文主要围绕着高灵敏度化学发光免疫分析新方法的建立和应用开展了一系列研究，对于体液和环境污染物的大规模筛选和检测方面有非常重要的学术意义和应用价值。全文共分为五章，分述如下： 第一章本章综述了化学发光免疫分析的基本原理及应用。根据标记物的不同，化学发光免疫分析主要分为三大类：化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。我们对此三大类反应机理及应用作了详细介绍，并对目前发展的新方法作了概述。引用文献112 篇。 第二章 以磁性酶免疫测量分析为模型，建立了微板式磁化学发光酶免疫分析法。利用3-（2′-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3″-羟基）苯1，2-二氧杂环丁烷磷酸钠（AMPPD）-碱性磷酸酶（ALP） 化学发光体系对人绒毛膜促性腺激素（HCG）进行测定，测量的灵敏度较分光光度法提高了13 倍，所需的试剂和样品量均减为分光光度法测量所需的1/10。测定的线性范围为0.15~500mIU/mL；批内C.V.%和批间C.V.% 均在18%之内；回收率在80%~116%之间；利用本法对血清样品进行了测定，并与其它化学发光免疫分析方法进行了比较，其相关系数为0.9650。首次将酶免疫分析方法用于唾液中人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定，为建立非侵入式样品测定方法打下了基础。 第三章 分别使用亲和素（Avidin）-生物素（Biotin） 体系和异硫氰酸荧光素(FITC)-anti-FITC 体系作为固相，发展了两种不同固相化学发光免疫分析方法并将其应用于临床白蛋白的测定。Avidin 或 anti-FITC 抗体包被在96-孔聚苯乙烯酶标板上，可以作为一个通用的固相应用于各种物质的免疫分析。这样，不仅可以减少批间分析的误差，而且灵敏度也得到了提高。向两种不同固相中加入生物素化的或FITC 标记的白蛋白抗体，温育反应后，加入的碱性磷酸酶（ALP）标记白蛋白和白蛋白标准液或样品将与抗体发生竞争性反应。结合上的酶标物与化学发光底物-螺旋金刚烷3-（2′-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3″-羟基）苯1，2-二氧杂环丁烷磷酸钠(AMPPD)发生化学反应产生化学发光，通过发光强度对待测物进行定量。对各种不同的物理化学参数诸如温育时间、洗涤剂的浓度以及固相条件进行了优化。两种不同固相化学发光免疫分析方法测定白蛋白，其线性范围和检测限均为0.15~15 μg/mL 和 0.089 μg/mL, 与商业化的ELISA 试剂盒测定结果相比，有一个好的相关性。另外，三种不同的固相包括 Avidin-Biotin 体系, FITC-anti-FITC 体系 和抗-白蛋白抗体的直接包被进行了比较，结果发现 (1) 当使用 Avidin-Biotin 体系作为固相时，白蛋白使用量仅仅是FITC-anti-FITC 体系作为固相或直接包被时的1/10。(2) 使用Avidin-Biotin 体系 和FITC-anti-FITC 体系作为固相时，其 C.V. 值均低于直接的抗体包被。 第四章 发展了一种微板式磁化学发光酶免疫分析（MMCLEIA）新方法，筛选水体样品中的17β-雌二醇（E2）。采用自己设计的磁感应强度为2500T 的微板磁性分离器，结合高灵敏度的化学发光体系，在一定程度上可以对水体中雌性激素直接高通量的筛选，进而避免了繁琐的前处理过程。考察了水体中共存的主要三种雌性激素，17β-雌二醇 (E2), 雌三醇 (E3)和 乙炔基雌二醇（EE2）的偶联反应，结果发现这种测定方法有很好的特异性。 MMCLEIA 方法对使用于大规模的样品筛选具有非常重要的意义。本方法测定E2 的线性范围是 10-3000 pg/mL，检测限为 5.4 pg/mL。批内分析和批间分析均小于15%。另外，几个影响免疫分析的物理－化学参数如抗体－抗原的比率，温育时间以及洗涤剂的浓度等也进行了考察。本方法已成功应用于海水中雌二醇的初步检测，与化学发光酶联免疫吸附分析法相比，具有很好的相关性。 第五章 建立了一种高灵敏度、高选择性的化学发光酶免疫分析方法，并将其应用于废水中17β-雌二醇(E2)的测定。采用FITC-anti-FITC 体系作为固相，生物素-亲和素体系作为信号放大体系，高灵敏度的AMPPD-ALP 化学发光体系作为信号检测体系。测定实际样品时，使用固相萃取方法进行样品前处理，以消除基体效应的干扰。对固相条件、pH 值、吐温-20 和BSA 浓度以及特异性进行了考察和研究，结果发现水体中常见的三种雌性激素的偶联效率均小于1%。在最优条件下测定E2 的线性范围是 2.5~1600 pg/mL，检测限为 1.5 pg/mL，回收率是80-110%。本方法已成功用于废水中E2 的测定，与商业化的放射免疫分析(RIA)试剂盒相比，具有良好的相关性。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 公开日期 | 2011-08-17 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/633]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 赵利霞. 化学发光酶免疫分析方法研究和应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2005. |
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