| 题名 | 植物体内砷酸盐还原的生物化学与分子生物学研究 |
| 作者 | 段桂兰 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2006-06-01 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 朱永官 |
| 关键词 | 砷 蜈蚣草 水稻 砷酸盐还原酶 植物修复 基因工程 arsenic Chinese brake fern rice arsenate reductase phytoremediation genetic engineering. |
| 其他题名 | The Biochemical and Biomolecular Mechanisms of Arsenate Reduction in Plants |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 砷污染是全球环境问题的热点之一，严重威胁着人类的健康和生命安全，东南亚地区污染尤其严重，中国也是受砷污染最为严重的国家之一。土壤砷污染治理是世界各国共同面临的一个急需解决的难题。传统的工程、物理化学等土壤砷污染治理方法不仅投资与维护成本高，而且操作复杂，容易造成二次污染，破坏土壤结构，降低土壤自净能力。随着砷超富集植物蜈蚣草的发现和现代分子生物学技术的迅速发展，植物修复技术和基因工程技术越来越受到世界各国政界、科技界、企业界的重视和青睐。要成功利用植物修复技术和基因工程技术来修复砷污染土壤，就必须深入理解植物体内砷代谢和解毒机制。 近年来，有关微生物体内砷解毒机制的研究已经相当深入，研究显示环境中的砷大部分以As(V)的形态进入微生物体，进入微生物体内的As(V)首先被砷酸盐还原酶还原成As(III)，As(III)进一步被螯合或甲基化，产物被转运至液泡中或直接排出细胞，从而达到解毒的目的。然而，植物作为土壤中砷迁移转化的重要途径，其体内砷解毒机制的研究在国内外尚属少数，尤其是基因和蛋白质水平的研究，这正是本论文主要研究的问题。 本论文利用RT-PCR、His-tag蛋白质纯化、基因芯片等先进的实验方法和技术，从基因和蛋白质水平深入研究了蜈蚣草和水稻这两种典型植物体内砷还原的生物化学与分子生物学机制。 （1）蜈蚣草体内砷酸盐还原酶的特性和还原反应的机制 蜈蚣草是第一种被发现的砷超富集植物，地上部积累的砷可达植物干物重的2%以上，是修复土壤砷污染的理想植物，尤其适用砷污染严重的矿区和已抛荒的农田。深入研究蜈蚣草砷富集和砷解毒的机制，尤其是对关键酶的特性和表达调控规律的研究，将对成功利用蜈蚣草来修复土壤砷污染非常重要。研究显示，蜈蚣草根的蛋白质提取物能把As(V)还原成As(III)，其还原反应的机制与酵母砷酸盐还原酶的反应机制类似。对底物的特异性和抑制物的敏感性也与酵母砷酸盐还原酶类似。但蜈蚣草体内的砷酸盐还原酶对底物As(V)具有更强的亲和力，砷酸盐还原酶活性显著高于其他非超富集植物。这些结果证明高效的砷酸盐还原酶是蜈蚣草进行砷富集和砷解毒的关键机制之一。 （2）水稻砷酸盐还原酶的基因克隆和蛋白质功能分析 尽管植物修复技术将是土壤治理砷污染的有效途径，但该技术不适应于稻田砷污染的治理，因为蜈蚣草不能代替水稻来生产粮食。基因工程技术将是提高砷污染地区水稻产量和品质的理想途径。因此，克隆水稻体内砷解毒的关键基因，分析其功能，并研究其表达调控规律是非常重要的。水稻砷酸盐还原酶是水稻体内砷代谢和解毒的关键酶。本研究克隆并鉴定了水稻体内的两个砷酸盐还原酶基因：OsACR2.1 (编码137个氨基酸，分子量为14,963 Da；基因库注册号为AY860059)和OsACR2.2 (编码130个氨基酸，分子量为14,330 Da；基因库注册号为AY860058)，两个蛋白质都具有HC(X)5R催化反应模体。将OsACR2s表达到大肠杆菌和酵母体内，他们既能恢复大肠杆菌砷酸盐还原酶基因(△ArsC)被敲除突变体对As(V)的抗性，也能互补酵母菌砷酸盐还原酶基因(ScACR2)被破坏的突变体菌株。纯化的OsACR2s蛋白质能在体外将As(V)还原成 As(III)，Sb(V)还原成Sb(III)。说明OsACR2s基因的产物不论在体内还是在体外都有将As(V)As(V)还原成As(III)As(III)的功能。同时，纯化的OsACR2s蛋白质在体外也具有磷酸酶活性，能水解对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate, pNPP)。对OsACR2s模体HC(X)5R中半胱氨酸进行点突变，则细胞对As(V)抗性显著减弱，突变体蛋白质还原酶活性的显著下降，并且完全丧失磷酸酶活性。 （3）砷胁迫下水稻基因表达调控规律的探讨 现代分子生物学的研究显示，细胞内基因的表达是相互关联，共同调控的复杂信息网络。本研究通过基因芯片技术探讨了砷胁迫下水稻基因表达调控规律，以便站在更高层次全面地理解基因之间复杂的表达调控规律和相关基因之间的信息网络，为基因工程技术筛选出更多的基因资源。本论文使用Affymetrix公司的水稻基因芯片比较了水稻基因组5万多个基因在没有砷胁迫和有砷胁迫情况下基因表达水平的差异。水稻在砷的胁迫下，有3000多个基因表达上调，其中上调100倍以上的有7个，上调10至100倍的有142个；基因表达下调基因也3000多个，其中下调100倍以上的有4个，下调10至100倍的有109个。 半定量PCR结果显示，磷砷交互作用能改变OsACR2s的表达。砷能诱导OsACR2s的表达，并且在缺磷和供砷的双重胁迫下表达最早最强。 总之，本论文研究了水稻和蜈蚣草砷还原的生物化学与分子生物学机制。研究结果对于利用蜈蚣草修复受砷污染的土壤具有重要的实践指导意义；并且，将为改善砷污染地区水稻的产量和品质提供基因资源和品种改良方向。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 环境化学 |
| 公开日期 | 2010-06-23 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/421]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_土壤环境科学实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 段桂兰. 植物体内砷酸盐还原的生物化学与分子生物学研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2006. |
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