miRNA在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用

CORC > 海洋研究所 > 中国科学院海洋研究所 > 实验海洋生物学重点实验室

题名	miRNA在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用
作者	陈浩1,2
答辩日期	2017-06
文献子类	博士
授予单位	中国科学院大学
授予地点	北京
导师	宋林生研究员
关键词	长牡蛎表观遗传潮间带适应机制神经内分泌免疫调节网络免疫应答干露胁迫
其他题名	miRNA-mediated Modulation in the Stress Response of Oyster Crassostrea gigas
学位专业	marine biology
英文摘要	潮间带区域环境复杂多变，长牡蛎作为典型潮间带生物，终生营固着方式生存于潮间带区域，进化形成了较强的抗病原侵染、抗干露胁迫等抗环境胁迫机制。miRNA作为重要的表观调控手段，能够在转录后水平调控基因表达，参与免疫应答等生理过程。然而目前对miRNA的研究主要集中于高等动物或其他模式生物中，在无脊椎非模式生物中的研究还处于起步阶段。本研究以长牡蛎为材料，通过分子生物学、细胞生物学与生物信息学的手段，鉴定了长牡蛎血淋巴细胞miRNA，并概述了其在神经内分泌免疫调节系统中的作用；基于长牡蛎免疫过程，筛查了关键代表性miRNA，并解析了其在病原胁迫下介导的免疫应答调控机制；通过多组学整合分析，筛选了干露胁迫相关miRNA，探究了其介导的干露适应调节机制。通过二代测序技术结合生物信息学分析，对长牡蛎miRNA进行了全基因组范围的筛查及鉴定，在长牡蛎中发现了331条miRNA，其中76条为保守miRNA，255条为全新miRNA，长牡蛎中鉴定出的miRNA数量为已知贝类中最多。有38条长牡蛎miRNA同时被发现响应免疫调质乙酰胆碱ACh或去甲肾上腺素NE刺激，并能够靶定355个长牡蛎基因，其中包括免疫识别受体，免疫通路信号分子，免疫效应分子及神经内分泌相关分子等。从长牡蛎中鉴定出保守miRNA cgi-miR-92d，其表达水平在免疫应答早期显著下调，在免疫应答后期迅速升高。CgLITAF3作为长牡蛎LITAF同源基因及cgi-miR-92d的靶基因，其表达水平在免疫应答早期迅速上升，在免疫应答后期显著下降。体外双荧光实验结果表明，cgi-miR-92d能够通过结合CgLITAF3编码区抑制其表达。体外过表达实验表明，CgLITAF3能诱导HEK293T细胞中HsTNF-α表达，且诱导效果受cgi-miR-92d抑制。CgTNF作为长牡蛎TNF-α同源基因，其表达水平在免疫应答早期显著升高，而在免疫应答后期显著下降，且趋势晚于CgLITAF3。研究发现，病原刺激后，敲减长牡蛎体内cgi-miR-92d能够显著降低CgLITAF3及CgTNF表达水平。 scaffold42648_5080是长牡蛎特有miRNA，编码于长牡蛎基因内含子区域。scaffold42648_5080能响应LPS刺激且在免疫应答早期显著下调。同时能够靶定包括CgILK在内的31个长牡蛎基因，参与细胞通讯、定位、应激反应等调控过程。其中，CgILK作为长牡蛎integrin通路中核心信号转导分子，同样能响应LPS刺激且显著上调。通过双荧光素酶报告基因实验证实，scaffold42648_5080能够在体外结合CgILK 3’-UTR，并抑制其表达。在免疫应答过程中，长牡蛎血细胞迁移能力随CgILK表达量的升高或降低而发生相应变化，在体内敲减scaffold42648_5080后，CgILK表达水平显著升高，长牡蛎血淋巴细胞迁移能力显著升高。免疫细胞吞噬作用是机体清除外来病原的重要机制，受NF-κB等通路调控。灿烂弧菌刺激后长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高而NF-κB通路中核心抑制因子CgIκB2表达水平显著降低。体内敲减CgIκB2基因后，长牡蛎血淋巴细胞吞噬能力显著升高。长牡蛎能够编码一个无脊椎动物特有的miRNA cgi-miR-2d。灿烂弧菌刺激后，其表达水平迅速升高，趋势与CgIκB2基因相反。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验显示，cgi-miR-2d能够结合CgIκB2 3’-UTR并抑制其表达。同时，在长牡蛎体内过表达cgi-miR-2d后，CgIκB2基因表达水平显著降低，细胞吞噬能力显著升高；在长牡蛎体内敲减cgi-miR-2d后，CgIκB2基因表达水平略有升高，细胞吞噬能力迅速降低。乙酰胆碱ACh是胆碱能神经系统主要的神经递质，也是重要的免疫调质。贝类具有原始的胆碱能神经免疫调节系统，并能参与调控其免疫反应。研究发现，灿烂弧菌刺激12小时后，长牡蛎血淋巴细胞中ACh显著升高，同时长牡蛎胆碱转运体同源基因CgCTL1表达量在免疫应答前期降低，在免疫应答后期恢复正常。敲减CgCTL1后，长牡蛎血淋巴细胞内胆碱及细胞外ACh含量显著降低，CgTNFs表达水平显著升高。生物信息学分析及双荧光实验表明，cgi-miR-2d能够结合CgCTL1 3’-UTR并抑制其表达。体内过表达cgi-miR-2d后CgCTL1表达水平显著降低，血淋巴细胞内胆碱转运与ACh合成释放迅速下降，CgTNFs表达水平升高；体内敲减cgi-miR-2d后，CgCTL1表达水平显著升高，血淋巴细胞内胆碱含量显著增加，细胞外ACh含量及CgTNFs表达水平保持不变，细胞抗菌能力显著降低。去甲肾上腺素NE是高等动物儿茶酚胺能系统中主要的神经递质，也是重要的应激激素。长牡蛎具有原始的儿茶酚胺能系统，并在干露胁迫后迅速激活。干露胁迫后cgi-miR-365表达水平显著升高，且在NE受体封闭后降低表达。靶基因分析表明，cgi-miR-365能够靶定CgHSP90AA1在内15个长牡蛎基因，参与调控物质代谢及胁迫应激等生理过程。其中，CgHSP90AA1能响应NE刺激并在干露胁迫后表达升高。双荧光实验表明，cgi-miR-365能够结合CgHSP90AA1 3’-UTR并促进其表达。在长牡蛎原代细胞中过表达cgi-miR-365后，CgHSP90AA1表达水平显著升高。在干露胁迫的长牡蛎中敲减cgi-miR-365后，CgHSP90AA1表达水平则显著降低。长牡蛎钙调蛋白CgCaM是细胞内重要的钙离子结合蛋白，能够激活一氧化氮合酶NOS，促进NO合成释放。NO是细胞内重要的炎症调控因子，参与调节细胞因子表达。干露胁迫后，长牡蛎血淋巴中CgCaM与细胞因子CgTNF等表达水平、NOS活性、NO含量呈现相似的先降低后升高的趋势，而钙离子浓度持续升高。对CgCaM进行抑制剂注射或体内敲减后，发现NOS酶活、NO含量、CgTNF等细胞因子表达水平均显著降低。研究发现scaffold631_909、cgi-miR-7、scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c、cgi-miR-92e、cgi-miR-92f、scaffold1600_212等8个长牡蛎miRNA能够调控CgCaM。与此同时， scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212等6个miRNA在干露后迅速上调表达，后期表达回落。双荧光实验表明，以上miRNA能够在体外结合CgCaM 3’-UTR并抑制其表达。同时，干露胁迫后，在长牡蛎体内过表达单一miRNA，CgCaM表达水平显著降低，NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平显著降低；而敲减单一miRNA，CgCaM表达水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平则无显著变化。干露胁迫中同时敲减scaffold43988_2479、cgi-miR-92a、cgi-miR-92c及scaffold1600_212，CgCaM表达水平、NOS酶活、NO含量、CgTNF表达水平则显著升高。干露胁迫中持续注射CgCaM或NOS的抑制剂CDZ或L-NMMA后，长牡蛎肝胰腺损伤情况显著好转。本研究的结果表明，长牡蛎具有复杂的miRNA介导的环境胁迫应答调控机制，能够通过靶定免疫识别受体，免疫通路信号分子，免疫效应分子及神经内分泌相关分子等系统地调控机体免疫应答反应及干露胁迫应答反应， miRNA调控机制对于长牡蛎适应潮间带环境具有重要生理意义。
语种	中文
学科主题	海洋生物学 ; 分子生物学
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/136543]
专题	海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室
作者单位	1.中国科学院海洋研究所 2.中国科学院大学
推荐引用方式 GB/T 7714	陈浩. miRNA在长牡蛎环境胁迫应答中的调控作用[D]. 北京. 中国科学院大学. 2017.