2015年，我们课题组和中国科学院动物研究所陈大华组合作，证实果蝇基 因组 DNA上含有大量的 6mA（6mA/dA，0.001~0.07%），并且其紧密调控果蝇 早期胚胎发育和转座子表达。这与 6mA在秀丽隐杆线虫以及哈德莱茵衣藻中的 研究一起，共同表明 6mA是一种新的真核基因组表观遗传印记。随后，在小鼠、 斑马鱼、猪和人等高等动物基因组 DNA中也检测到 6mA的存在。现有少数几 种检测 6mA的分析方法，如超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）、抗体 依赖的免疫分析和 DNA测序等。然而，LC-MS和抗体依赖的实验面临细菌污染 的难题。DNA测序技术虽然能够通过测序结果与实验物种的基因组序列比对从 而扣除来自细菌的 6mA干扰，但它可能同样需要抗体富集含有 6mA的 DNA片 段以用来测序。为此，我们开发了一种基于稳定同位素标记的脱氧腺嘌呤核苷 （[15N5]-dA）示踪， UHPLC-MS/MS检测的方法，来精确和快速地检测细胞基 因组真实的 6mA水平。 当 HEK293T细胞暴露[15N5]-dA时，仅以[15N4]-dA的形式掺入基因组 DNA。 Q-TOF-MS的 Target MS/MS模式的分析结果表明，[15N4]-dA的环外氨基上为普 通的 14N原子。因而，我们推测在细胞内 [15N5]-dA→[15N4]-dA的生物过程可能 是腺苷脱氨酶 Ada介导的。 为了证实这一猜测，我们采用 siRNA敲低 Ada的表达，和阴性对照组相比 [15N4]-dA/dA和[15N4]-dG/dG分别下降了 37.2%和 31.8%，表明在这一过程中 Ada 确实发挥了作用，但未检测到[15N5]-dA。为了证实以上结果，我们采用不同浓度 的 Ada抑制剂（EHNA）抑制 Ada活性，发现和对照组相比 [15N4]-dA/dA和 [15N4]-dG/dG分别下降了 75%−96.4%和 75.4−96.8%，同时检测到了[15N5]-dA，但 是[15N5]-dA /dA不超过 5%。以上结果表明，Ada介导的嘌呤补救合成途径的确 是[15N5]-dA掺入 DNA的主要途径。 共生于 293T细胞的支原体，既能够摄取培养基中 [15N5]-dA，也能够摄取宿 主核酸池中的 [15N4]-dA和[15N4]-dG。然而， 293T细胞主要摄取核酸池中的 [15N4]-dA和[15N4]-dG。利用支原体 DNA富有 [15N5]-dA和[15N5]-6mA而人细胞 富有[15N4]-dA和潜在的[15N4]-6mA的特点，该方法能够区分细胞是否发生支原因为扩增自细菌的质粒无 15N标记，所以质粒携带的 6mA也无 15N标记，因而可以采用[15N5]-dA示踪的方法将质粒 DNA 6mA和细胞 DNA [15N4]-6mA区 分开来。 利用上述原理，我们评估了细菌 DNA N6-腺嘌呤甲基转移酶（Dam）在细胞 内的活性。突变体DamD181N拥有较野生型Dam低约100倍的甲基转移酶活性， 但采用 [15N5]-dA示踪， UHPLC-MS/MS检测的方法仍然可以检测到 2.8个 [15N4]-6mA/106 dA，即使此时存在高达≈500个 6mA/106 dA的背景干扰。而作 为阴性对照，EGFP和 DamP183R过表达均未显示甲基转移酶活性。以上结果表 明，[15N5]-dA示踪能够准确地、灵敏地评价外源蛋白在细胞内 DNA N6-腺嘌呤 甲基转移酶活性。 鉴于一些细胞不能利用胸腺嘧啶脱氧核苷来评价细胞增殖，我们试图建立 [15N3]-dC标记 DNA合成来评价细胞增殖的方法。 首先，我们证实 [15N3]-dC掺入小鼠胚胎干细胞基因组 DNA的形式为 [15N3]-dC和[15N2]-dT。当细胞暴露 10 µM [15N3]-dC时，[15N2]-dT/dT和细胞增殖 呈正相关（0−24 h），是较[15N3]-dC/dC更为理想的评价细胞增殖的指标。而在撤 掉示踪剂[15N3]-dC后，[15N3]-dC/dC和[15N2]-dT/dT的对数和细胞数目的对数呈 负相关，二者均是评价细胞增殖的理想指标。另外，不同 [15N3]-dC的剂量和不 同的细胞铺板密度影响[15N3]-dC/dC和[15N2]-dT/dT的标记比例。以上结果表明， [15N3]-dC在一定的条件下，可以用来评价细胞增殖。采用[15N3]-dC示踪的方法， 我们发现 Tet1-/ Tet2-/ Tet3-三敲的 mES细胞拥有较野生型更快的细胞增殖速度。