| 题名 | 敲除恒河猴造血干细胞CCR5基因治疗SIV感染的实验研究 |
| 作者 | 余松林 |
| 答辩日期 | 2017-04-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 陈小平 |
| 关键词 | 艾滋病 恒河猴 造血干细胞 CRISPR/Cas9 CCR5 |
| 学位名称 | 理学博士 |
| 其他题名 | Ablation of CCR5 gene in hematopoietic stem cells of rhesus monkeys to treat SIV infection |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | 人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（艾滋病，AIDS）是一种难以根治的慢性传染病。尽管抗逆转录病毒疗法可以有效控制病毒复制，并改善患者生存，但药物副作用及耐药毒株的出现，促使人们不断开发新的艾滋病治疗策略。2007年一位感染HIV-1且身患白血病的男子，经过异体移植CCR5基因天然缺失32个碱基（CCR5Δ32/Δ32）的供者骨髓后，至今仍未检测到体内病毒的反弹，且身体状况良好，被公认是全球第一例被治愈的艾滋病患者。后续的研究表明，CCR5Δ32/Δ32基因型的供者骨髓是实现根治的关键。然而天然携带CCR5Δ32/Δ32基因型的人数稀少，且存在HLA配型等问题，限制了此疗法的推广。因此对HIV-1患者自身造血干细胞进行CCR5基因的人工敲除并自体回输，将可能实现最终的艾滋病功能性治愈。恒河猴是艾滋病研究的理想模型。首先猴与人的遗传背景非常接近；其次， SIV感染恒河猴的病程和病理特征与HIV-1感染人的情况十分相似。因此，用恒河猴感染SIVmac251作为慢性感染模型，对于临床治疗HIV-1感染具有重要的参考意义。然而，目前对于恒河猴分化的外周原代细胞的基因修饰，所能运用的技术手段较少，且不够稳定。本研究首先比较了TALEN和CRISPR/Cas9两种基因编辑技术在修饰人、猴细胞内源性基因方面的有效性和安全性。通过优化靶点选择，改进传递方法，在细胞系上实现高效、稳定的CCR5和/或CXCR4基因敲除。特别的，在原代的CD4+T细胞上，通过电穿孔传递Cas9蛋白及sgRNA，可以同时敲除CCR5和CXCR4基因，并赋予这些修饰过的T细胞体外抵御X4/R5双嗜性HIV-1感染的能力。较低的脱靶效应证明了CRISPR/Cas9应用于临床治疗AIDS的安全性。为了满足恒河猴基因治疗的技术要求，我们建立了基于SIV的sgR5/Cas9慢病毒系统，可有效感染恒河猴造血干细胞（HSC）并对CCR5基因进行敲除，而且基因修饰的HSC可以体外形成多种造血系的集落（CFU）。为了建立艾滋病治疗性模型，本研究选择SIVmac251感染的中国恒河猴，在病毒感染进入慢性期后开始长达一年的抗逆转录病毒治疗（ART），随后对患猴造血动员，利用血液成分分离机采集外周血的造血干祖细胞（HSPC）并冻存。利用sgR5/Cas9慢病毒对HSPC细胞进行体外的基因敲除，待动物恢复生理状态后，自体回输给经过亚致死剂量白消安预处理的SIV感染猴。我们对分选的CD34+HSPC细胞基因组中的SIV前病毒（SIV iDNA）进行检测，结果显示SIV iDNA拷贝数低于Alu-PCR法检测下限，表明长期ART治疗可以抑制SIV病毒入侵骨髓中的HSPC。 sgR5/Cas9处理过的HSPC细胞CCR5基因敲除效率最高可达到16%。在观察期内，所有接受CCR5修饰并存活的猴生理指标基本保持稳定。对血浆病毒载量的跟踪检查显示，有2只CCR5敲除猴在ART终止后表现出病毒反弹的延迟。其中RM 31猴血浆病毒载量和SIV 前病毒拷贝数均维持较低的水平；CD4/8+T绝对计数均稳定上升；CCR5+CD4+T细胞比例下降明显且维持较低水平；此外，该猴CD4+T细胞中大部分为效应记忆T细胞（TEM），而中枢记忆性T细胞（TCM）比例较低，表明该猴CD4+T细胞中能够维持长期抗病毒效力的细胞群较少。另外1只CCR5敲除猴（RM C3）的血浆病毒载量有轻度的反弹，达到458cps/mL。其它的各项指标与RM 31号猴类似。可能是由于基因修饰的效率不够高，也可能是因为移植后恢复重建造血功能不足。更长时间的观察，将有助于进一步明确不同处理组的感染猴针对SIV的免疫保护效力，从而全面地评价CCR5修饰对于控制病毒感染，维持免疫平衡的作用。本研究是首次在SIV阳性恒河猴中尝试改造患猴自身造血干细胞，并自体回输治疗SIV感染。在部分基因修饰的恒河猴中初步观察到ART停药后依然维持对病毒的抑制及免疫功能的维持，这种免疫保护力的获得是由于CCR5敲除的HSC重建免疫系统而引起的。这从概念上验证了利用HIV-1患者自身HSC来治疗AIDS的可行性，为未来的临床试验打下了基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 137 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1140]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 余松林. 敲除恒河猴造血干细胞CCR5基因治疗SIV感染的实验研究[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2017. |
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